Marcación de proteínas con 125I y determinación experimental de su actividad específica

Abstract

El objeto del presente trabajo consiste en la normalización de la técnica de marcación de proteínas con 125I y de los procedimientos de control de los productos obtenidos, en especial sus actividades específicas, con el fin de utilizarlos correctamente en radioinmunoensayos. Las cantidades de Cloramina-T y metabisulfito de sodio fueron disminuidas con respecto a las del método original, a 3,6 y 9,6 fig respectivamente. En estas condiciones se obtuvieron rendimientos óptimos y las proteínas radioiodadas poseían una buena actividad inmunológica. Se observó que la actividad específica calculada, como es corriente, a partir del rendimiento obtenido por electroforesis, es mayor que el valor real. Ello se debe a que una cierta cantidad de iodo radiactivo no unido a la proteína, queda en la zona correspondiente a la proteína marcada, si el análisis se efectúa por electroforesis. Esta diferencia no fue observada cuando el producto fue analizado cromatográficamente, proteína puesta a reaccionar, a partir de su actividad absoluta. Por estas razones los rendimientos de marcación y las correspondientes actividades específicas fueron determinadas mediante cromatografía ascendente, usando metanol al 70% como solvente, durante dos horas en la oscuridad. Las curvas de desplazamiento de los radioinmunoensayos, obtenidos con proteínas marcadas con el método propuesto y cuyas actividades específicas fueron calculadas a partir de sus perfiles radiocromatográficos, fueron reproducibles y dieron una ordenada en el origen (fracción de proteína radioiodada unida en ausencia de proteína fría, BQ) de 50 + 4 por ciento. Las uniones no específicas fueron siempre inferiores a 5 por ciento. El presente trabajo ofrece por lo tanto la posibilidad de determinar la actividad específica real de las proteínas radioiodades mediante una simple cromatografía, lo que debe considerarse como un paso más hacia la normalización metodológica del radioinmunoensayo.